Nelle Tabelle 1 e 2 sono indicate le concentrazioni di un mezzo di coltura normalmente utilizzato in laboratorio. La seconda tabella si riferisce al terreno di coltura per la patata dolce americana (Batata), ma è utile per capire quali componenti comunque sono necessari: a seconda delle specie che ci interessa cambiano le concentrazioni ma le sostanze organiche sono sempre le stesse. In particolare, NAA e BAP sono degli ormoni stimolanti: NAA o acido 1-naftilacetico o alfa-naftalenacetico è uno stimolante della radicazione di talee, BAP è un fitostimolatore della fase vegetativa. Inoltre si può aggiungere IAA, o auxina, (0.1 mg/l)) che è un ormone regolatore della crescita delle piante nonchè della radicazione.

Tabella 1: Composizione della soluzione salina di base secondo Murashige and Skoog (1962)

Tabella 2: Additivi organici in un mezzo di coltura per la patata dolce

Quello preparato sopra è il terreno di base per iniziare a formare i calli cellulari.

Per la preparazione del terreno di moltiplicazione o il terreno di radicamento si aggiunge mezzo bicchiere di latte di cocco e mezza tavoletta di malto. Il latte di cocco può essere sostituito con mezzo bicchiere di polpa di pomodoro verde, o mezzo bicchiere di succo di arancia fresco.

Però ognuno di questi ingredienti può dare risposte diverse e deve essere verificato per il tipo di pianta che vogliamo fare crescere.

Il pH del terreno deve essere compreso fra 5 e 6; se diverso può essere rettificato con acido citrico o bicarbonato di sodio. Si mescolano gli ingredienti e si scaldano fino a sciogliere l’agar. Quando la soluzione si sta raffreddando ma l’agar è ancora in fase liquida si versa il terreno nei vasetti di vetro fino a formare uno spessore di circa 2 cm. Si chiude il tutto e si mette nella pentola a pressione. Quando la valvola della pentola fischia si lasciano nella pentola per 15 minuti.

Le forbicine, gli scalpellini, le pinzette, prima di iniziare il lavoro, devono essere lavati e risciacquati accuratamente per eliminare ogni residuo di detergente, infine devono essere sterilizzati nella pentola a pressione. Durante il lavoro possono essere sterilizzati con la soluzione di candeggina e fiammati. Per sterilizzare la carta si mette in un supporto non coperto dall’acqua nella pentola a pressione e si sterilizza sempre per 15 minuti.

Il materiale vegetale può essere sterilizzato in una soluzione diluita di candeggina: 1/4 di candeggina + 1/4 di acqua + una goccia di detergente che agisce da surfattante, cioè riduce la tensione superficiale e stabilizza la sospensione. Si mettono i pezzi di pianta in un vasetto contenente la soluzione per 10-20 minuti. Si agita e si butta la soluzione di candeggina. Si sciacquano i pezzi con acqua sterile.

Il punto essenziale della micropropagazione è che le colture devono essere libere da ogni contaminazione: batterica, virale e fungina. Ci sono perciò alcune regole da seguire, alcune possono sembrare banali, ma in realtà aiutano ad evitare anche contaminazioni accidentali.

1. Tirare indietro i capelli e le maniche e rimuovere anelli e braccialetti. Lavarsi le mani con una soluzione disinfettante, altrimenti mettersi dei guanti da laboratorio usa e getta e pulirli con l’alcol al 70%.

2. Sterilizzare la cabina sterile (l’acquario) con una soluzione al 70% di alcool e asciugare con tessuto sterile.

3. Riporre tutta la strumentazione necessaria nella cabina sterile dopo averla sterilizzata.

4. Il materiale vegetale non deve essere mai toccato con le mani ma sempre con le pinzette sterilizzate.

Ogni volta che si utilizza uno strumento va sterilizzato con alcool o la soluzione di candeggina e fiammato se possibile.

I piccoli pezzi di pianta (Fig.1), di lunghezza di circa 2-3 cm, vengono tagliati e posti nel terreno di base già sterilizzato. I pezzi inseriti nel terreno devono stare a temperatura ambiente sotto la luce diretta e con il contenitore chiuso. I pezzi da prelevare possono derivare da apici del germoglio, pezzi di foglie, pezzi a ridosso degli internodi, pezzi di radice.

Fig.1: piccole parti di foglia appena sezionate e pronte per essere messe nel mezzo di coltura

Non ci si deve certo aspettare che tutti i contenitori diano risultati soddisfacenti: alcuni pezzi di pianta possono essere uccisi o danneggiati dalla soluzione di candeggina, o uccisi dalle tossine prodotte dalle stesse piante, oppure possono contaminarsi con funghi e batteri (Fig.2). Queste colture danneggiate o infette vanno eliminate.

Fig.2: colture vegetali contaminate

Una volta che il germoglio si è formato (fig.3), si può trasferire nel mezzo di coltura per il radicamento, quello contenente latte di cocco e malto (fig.4)

Fig.3: accrescimento della piantina fino alla radicazione

Fig.4: plantula radicata

Le radici di solito si formano in 2-4 settimane. Una volta che si sono formate le radici si passa all’acclimatazione. Si rimuovono le plantule radicate dall’agar con una forbicina e si lava via l’agar con acqua tiepida. Si invasano le plantule in terriccio misto (senza fertilizzanti) umido.

Dopo questa operazione si spruzzano le piante con acqua. I vasetti vanno posti in contenitori di vetro o plastica trasparente chiusi posti sotto il sole in modo da aumentare l’umidità interna. Quando le piante cominciano a crescere e sono acclimatate si possono utilizzare.

Questa metodica che può sembrare molto semplice in realtà comporta una buona manualità, non tanto per il trasferimento delle piante o parti di esse nei vari passaggi quanto per il mantenere tutto l’ambiente di lavoro (la camera sterile e gli strumenti) sempre puliti. I pezzi di pianta e i calli che si producono da essa sono infatti altamente suscettibili ad infezioni perchè non hanno alcun tipo di difesa e inoltre i terreni di coltura così ricchi di sostanze favoriscono la crescita di batteri e funghi. In realtà nei laboratori si aggiungono ai terreni alcuni antibiotici (streptomicina, penicillina) e l’amfotericina B per i funghi, per avere una maggiore probabilità di successo.